Electroforeza hemoglobinei

Informatii generale

Hemoglobina reprezinta elementul esential pentru principala functie fiziologica a eritrocitului: functia respiratorie.

Hemoglobina este o cromoproteina porfirinica care contine fier, in structura sa intrand o parte proteica – globina – si o parte prostetica – hemul. Globina difera ca structura de la o hemoglobina la alta, ea imprimand specificitate diverselor hemoglobine cunoscute.

In cursul dezvoltarii organismului de la embrion la adult se succeda mai multe tipuri de Hb; hemoglobinele embrionare Gower 1, Gower 2 si Portland sunt inlocuite incepand cu cea de-a 3-a luna de gestatie de catre Hb fetala (HbF), care reprezinta 70-80% din totalul Hb la nou-nascut, dupa care sinteza sa scade rapid, ajungand la sfarsitul primului an de viata la valori sub 2% din totalul Hb. Hb A si Hb A2 sunt caracteristice perioadei adulte de dezvoltare; sinteza lor incepe inca  din perioada fetala, iar dupa nastere ele inlocuiesc rapid Hb F.

La adultul normal, Hb A reprezinta 97-98%, HbA2 2-3%, iar HbF sub 1%2.

Hb A este caracterizata in mod obisnuit prin mobilitatea sa electroforetica, prin afinitatea pentru O2 si prin viteza de denaturare in mediul acid si alcalin.

Hb F se caracterizeaza prin rezistenta crescuta la denaturarea alcalina, proprietate pe care se bazeaza si determinarea ei chimica, si prin afinitate crescuta la O2 in raport cu Hb A. Valori crescute de Hb F fata de normal se gasesc in diverse situatii fiziologice sau patologice: sarcina, anemii severe diverse, anemie Biermer, leucemii, hipertiroidie, persistenta ereditara de Hb F, β- talasemia hetero- si homozigota, alte hemoglobinopatii.

Hb A2 poate fi usor separata electroforetic de Hb A intrucat are o mobilitate electroforetica evident mai lenta decat a Hb A4.
Principiul metodei

Intr-un camp electric particulele incarcate cu o anumita sarcina electrica se deplaseaza in functie de intensitatea campului electric, de incarcarea lor electrica, de marimea si forma moleculei. In cazul hemoglobinelor anormale modificarea structurala duce la modificarea sarcinii electrice, ceea ce  permite migrarea si separarea lor electroforetica.

Electroforeza de Hb la un pH alcalin (8.2-8.6) folosind ca suport de migrare gelul agar este o metoda rapida si sensibila, permitand separarea Hb fiziologice si patologice, inclusiv a fractiilor minore3. La acest pH, hemoglobina prezinta o sarcina electrica negativa si va migra catre anod. La rularea fiecarui set de probe este folosit un control ce contine hemoglobinele A, F, S si C. Deoarece este utilizata o coloratie pentru proteine si nu una pentru hem, anhidraza carbonica (enzima cu un continut crescut in eritrocite) va fi vizualizata suplimentar in spatele benzii A2 (vezi figura 8.1.1)1;3.

Recomandari pentru efectuarea electroforezei de hemoglobina

Diagnosticul hemoglobinopatiilor si sindroamelor talasemice a caror suspiciune este indicata de:

• anemie hemolitica cronica;

• criza ocluziva vasculara de cauza necunoscuta la un pacient provenit din zone cu niveluri crescute ale Hb S si/sau Hb C;

• sindrom de hidrops fetal de cauza necunoscuta1;

• aspect sugestiv al hemogramei, cu microcitoza si hipocromie mai severe decat ar fi de asteptat pentru gradul anemiei si numar de eritrocite la limita superioara a normalului sau chiar crescut, asociate cu un numar mare de hematii „in tinta” si punctatii bazofile pe frotiul de sange. In aceasta situatie, pentru diferentierea de deficitul de fier, sunt utile indicele Mentzer si indicele RDW:

Indicele Mentzer = VEM/nr. de eritrocite (x106)
                        >14       sugestiv pentru deficit de fier;
                        12-14    echivoc
                        <12       sugestiv pentru tara talasemica.

Indicele RDW = Indicele Mentzer x RDW (largirea distributiei eritrocitare).
                          < 220:    sugestiv pentru talasemie;
                          ≥ 220:    sugestiv pentru anemia feripriva5.

Recoltarea

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)3.

Specimen recoltat – sange venos3.

Cauze de respingerea probei – specimen coagulat3.

Recipient de recoltare – vacutainer cu K3 EDTA3.

Cantitate recoltata – cat permite vacuumul3.

Prelucrare necesara dupa recoltare – Sangele se centrifugheaza. Eritrocitele se separa si se spala cu ser fiziologic. Apoi, ele sunt hemolizate folosind reactivul hemolizant din kit. Hemolizatul se supune electroforezei imediat; eventual, el poate fi pastrat la 2-8°C. Sangele integral si eritrocitele spalate, de asemenea, pot fi pastrate la 2-8°C. In nici un caz vacutainerul cu sange recoltat pe K3 EDTA nu se introduce in congelator!!! (se produce hemoliza)3.

Stabilitate proba – sangele integral este stabil 28 zile la 2-8°C2; eritrocitele spalate sunt stabile 28 zile la 2-8°C2; hemolizatul este stabil 36 ore la 2-8°C3.

Metoda si interpretarea rezultatelor

Metoda – electroforetica urmata de  scanarea densitometrica a fractiunilor obtinute3.

Valori de referinta – fractie  A:  >95%; fractie A2: 1.5-3.5%; fractie F: <2% .

Prin electroforeza hemoglobinei pot fi detectate fractiuni normale sau patologice, pozitia benzilor obtinute fiind comparata cu cea a benzilor standard furnizate de materialul de control.

Interpretarea rezultatelor

• in β-talasemia minima si minora valorile  Hb A2  sunt crescute (3,2%- 7%), iar Hb F este usor crescuta (0.5-6%) in peste 50% din cazuri, restul fiind reprezentat de Hb A;

• in β-talasemia intermedia, procentul de Hb A2 este variabil, iar Hb F = 20-80%;

• in β-talasemia majora, valorile de  Hb F sunt foarte crescute, situate obisnuit intre 20-90% din totalul Hb, restul fiind format de  Hb A (valori foarte scazute) si HbA2 (valori normale sau crescute); se caracterizeaza clinic prin tabloul clasic al anemiei Cooley;

• in afara de tipurile amintite, mai exista forme de β-talasemie cu valori normale de Hb A2 si Hb F  (“silent thalassemia” cu indici eritrocitari normali si “almost silent thalassemia” cu indici eritrocitari modificati) care pot fi puse in evidenta prin tehnici de genetica moleculara1;4;

• δβ-talasemia rezulta din deletia genelor δ si β cu mentinerea integritatii genelor γ, in timp ce in Aγδβ-talasemia se inregistreaza deletia genelor Aγ, δ si β cu mentinerea integritatii genei Gγ; heterozigotii prezinta un tablou hematologic similar β-talasemiei minore dar la electroforeza Hb, procentul de Hb A2 tinde sa fie redus la jumatate iar Hb F este persistent crescuta intr-o proportie de 5-20%; homozigotii prezinta un fenotip similar β-talasemiei intermedia iar electroforeza evidentiaza Hb F intr-un procent de aproape 100%; testarea genetica confirma diagnosticul1;

• Hb Lepore este o hemoglobina anormala, in care lanturile α sunt normale, iar lanturile non-α au o structura asemanatoare lanturilor δ la capatul N-terminal si lanturilor β la capatul C-terminal. Sindromul Lepore, foarte asemanator clinic, in forma sa heterozigota, cu  β-talasemia minora , se caracterizeaza electroforetic prin prezenta Hb Lepore intr-un procent de 5-10 %, cu migrare asemanatoare HbS si scaderea procentului de Hb A2; in forma homozigota, asemanatoare clinic cu anemia Cooley,  Hb Lepore reprezinta 10-20%, restul fiind format de HbF (Hb A si Hb A2 lipsesc in totalitate)2;

• persistenta ereditara de Hb F este o entitate asimptomatica clinic si hematologic, caracterizata prin valori crescute de Hb F, la heterozigoti Hb F = 15-30%, iar la homozigoti se poate ajunge pana la 100% Hb F, in afara oricarui semn de boala4;

• in forma heterozigota de siclemie (“sickle cell trait”) , electroforeza Hb sugereaza diagnosticul, punand in evidenta o Hb anormala, Hb S, in proportie de 25-45%, Hb A2 fiind in cantitate normala, iar restul fiind reprezentat de Hb A; confirmarea diagnosticului de siclemie se face prin testul de siclizare; cei mai multi pacienti cu tara de siclemie sunt asimptomatici, cu un frotiu de sange normal sau usor modificat (microcitoza sau hematii “in tinta”); coexistenta tarei Hb S cu anumite tipuri de talasemii sau alte hemoglobinopatii modifica tabloul clinic si hematologic precum si electroforeza Hb; in cazul obtinerii unei benzi cu migrare similara Hb S dar cu test de siclizare negativ va fi suspectata o Hb D sau G1;

• in forma homozigota de siclemie (“sickle cell anemia”), electroforeza Hb indica prezenta Hb S in proportie de 90-95%, restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F; tabloul hematologic este normal la nastere si incepe sa se modifice dupa varsta de 6 luni, pe masura ce Hb F este inlocuita de Hb S1;

• in hemoglobinopatia C, la electroforeza Hb in mediu alcalin, HbC se izoleaza  ca o fractie anormala, cu migrare foarte lenta, pe linia Hb A2, in aceeasi pozitie  cu Hb E si Hb OArabia, in valori procentuale de 38-44% la heterozigoti2; pentru diferentierea Hb C de Hb E si Hb OArabia este necesara efectuarea electroforezei la un pH acid (6-6.2); prezenta tarei Hb C nu prezinta semnificatie clinica insa este importanta in consilierea genetica a cuplurilor; homozigotii pentru Hb C (boala hemoglobinei C) prezinta urmatoarele caracteristici: anemie usoara/medie cu microcitoza marcata, numeroase hematii “in tinta” pe frotiul de sange periferic, iar la electroforeza hemoglobinei se izoleaza Hb C in proportie de 95%, restul fiind reprezentat de Hb A2 si Hb F1;

• in α- talasemia minora  nu exista modificari procentuale ale Hb A, Hb A2  si Hb F, iar electroforeza de Hb apare normala la subiectul adult heterozigot; insa dublu heterozigotii realizeaza “boala Hb H”, cu aspect clinic de talasemie intermedia, iar la electroforeza Hb la pH alcalin se poate evidentia  o fractiune anormala cu migrare rapida (cea mai apropiata de anod) corespunzatoare Hb H (5-30%)2. Genetica moleculara asigura insa diagnosticul de certitudine al tuturor formelor de α- talasemie1.

Limite si interferente

Transfuziile de sange pot dilua o eventuala hemoglobina anormala, pentru o perioada de 3-4 luni, interferand cu rezultatele electroforezei4.

Hiposideremia poate determina obtinerea de valori fals scazute pentru Hb A2; daca exista o neconcordanta intre rezultatul obtinut pentru HbA2 si suspiciunea clinica de betatalasemie minor, pacientul va fi tratat cu fier, pana la normalizarea sideremiei, apoi se va repeta electroforeza de hemoglobina2.

• Interferente analitice

– Centrifugarea ineficienta si/sau spalarea eritrocitelor cu solutii saline nu vor furniza o hemoliza clara. Aceasta poate rezulta in prezenta liniei rosii la aplicarea punctelor pe banda, ceea ce indica o calitate slaba a pattern-ului electroforetic.

– Probele inghetate pot produce benzi false langa cea a HbA3.