Mutatia factorului V Leiden-detectie si genotipare

Informaţii generale şi recomandări

Trombofilia reprezintă o condiţie ereditară sau dobândită asociată cu o predispoziţie individuală faţă de evenimente trombotice.

Principalele manifestări clinice generate de trombofilie sunt: boala tromboembolică, avorturile recurente de cauză incertă, complicaţii ale sarcinii (preeclampsie, retard de creştere intrauterină, apoplexia uteroplacentară, moartea fătului în uter, naştere prematură), sindroamele coronariene acute (angina instabilă, infarct miocardic), necroza aseptică de cap femural.

Trombofilia trebuie suspectată în următoarele situaţii clinice: evenimente trombotice survenite la pacienţi tineri (<50 ani), tromboze recurente, antecedente familiale de afecţiuni tromboembolice, complicaţii multiple ale sarcinii, tromboze venoase în teritorii anatomice “neobişnuite”: vena portă, vene hepatice, mezenterice, cerebrale, etc.

Până la 70% dintre pacienţii diagnosticaţi cu o forma de trombofilie prezintă unul sau mai multe defecte genetice majore. Dintre acestea, factorul V Leiden şi mutaţia G20210A a protrombinei sunt responsabile pentru mai mult de jumătate din cazurile de trombofilie ereditară. Aceste mutaţii sunt relativ recent descoperite (din 1994) şi au la baza substituţii nucleotidice unice, care pot fi detectate în prezent prin tehnici moleculare6.

Factorul V Leiden constituie o variantă anormală a factorului V ce devine rezistent la acţiunea proteinei C activate (APC). Este generat de o mutaţie punctiformă a genei de pe cromozomul 1q23 care codifică sinteza factorului V, prin substituţia guaninei (G) cu adenina (A) în poziţia 1691. În produsul proteic, substituţia nucleotidică se exprimă prin înlocuirea argininei din poziţia 506 cu glutamina (mutaţia R506Q). Factorul V astfel modificat este denumit factor Leiden, alterarea constând în modificarea situsului de legare a APC.

Ca urmare a acestei mutaţii, factorul V Leiden este inactivat de 10 ori mai lent decât cel normal şi persistă mai mult timp în circulaţie, cea ce conduce la o generare crescută de trombină şi astfel, la hipercoagulabilitate2;3.
Analizele genetice au indicat faptul că această mutaţie este responsabilă de 85-90% din cazurile de rezistenţă la APC4.
Mutaţia este transmisă autozomal co-dominant şi este prezentă la aproximativ 3-7% din populaţia caucaziană, fiind astfel cea mai frecventă cauză de trombofilie ereditară2.

Aceasta mutaţie a fost confirmată la pacienţi cu tromboză venoasă profundă, embolie pulmonară, ocluzia venei centrale a retinei, tromboza sinusurilor cerebrale şi tromboza venelor hepatice. Mutaţia este depistată la 10-20% dintre pacienţii aflaţi la primul episod de tromboză venoasă. De asemenea, 40% din pacienţii <50 ani aflaţi la primul episod de tromboză venoasa şi 60% din pacientele gravide cu tromboză venoasă sunt purtători ai acestei mutaţii.

Riscul de tromboză depinde de statusul homo- sau heterozigot pentru această mutaţie. Indivizii heterozigoţi au un risc de tromboză de 4-8 ori mai mare decât persoanele cu factor V normal, în timp ce homozigoţii prezintă un risc de 80-100 ori mai mare5.
Riscul creşte exponenţial la persoanele care asociază şi alţi factori de risc trombotic, cum ar fi: coexistenţa altor defecte genetice (deficit de proteină C, S, antitrombină III, mutaţia genei protrombinei, mutaţia genei care codifică metilentetrahidrofolat reductaza -MTHFR- şi se asociază hiperhomocisteinemie), consumul de anticoncepţionale orale, sarcina5;6.

Astfel, tromboza venoasă profundă şi tromboza sinusurilor cerebrale apar mai frecvent la pacientele care iau anticoncepţionale orale, gravide sau aflate în perioada postpartum6.

Middendorf şi colaboratorii săi au efectuat un studiu (2004) despre rolul factorului Leiden la pacienţii cu infarct miocardic. Concluziile studiului au fost că pacienţii care prezintă mutaţia factorului V Leiden au o predispoziţie pentru infarctul miocardic iar factorii tradiţionali de risc pentru boala coronariană ar avea un rol mai puţin important la aceşti pacienţi2.

În ceea ce priveşte complicaţiile sarcinii, prezenţa factorului V Leiden, ca şi cea a mutaţiilor genelor protrombinei şi MTHFR, se asociază cu un risc crescut de pierderi recurente de sarcină, în special în trimestrele II şi III1.

Screening-ul membrilor asimptomatici în familiile la care s-a depistat mutaţia nu este recomandat pe scară largă, datorita riscului scăzut de tromboze venoase letale. Cu toate acestea, investigarea poate aduce beneficii în situaţiile în care se au în vedere sarcina sau administrarea de contraceptive orale, la persoanele care au antecedente familiale de tromboze venoase recurente apărute la vârste < 50 ani. Persoanele care solicita testarea şi cele care obţin un rezultat pozitiv trebuie informate în legătura cu implicaţiile diagnosticului şi cu semnele sau simptomele care necesită intervenţie medicală de urgenţă2;6.

Testul efectuat în laboratorul Synevo utilizează tehnica real-time PCR pe instrumentul LightCycler pentru detecţia şi genotiparea mutaţei factorului V Leiden, la pacienţi cu suspiciune clinică de trombofilie4.

Recoltarea

Specimen recoltat – sânge venos4.

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant4.

Cantitate recoltată – cât permite vacuumul4.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant4.

Stabilitate probă – 7 zile la 2-8ºC4.

Metoda si interpretarea rezultatelor

Metodă – Real-time PCR (LightCycler): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise; la sfârşitul ciclurilor de amplificare se efectuează genotiparea, prin analiza curbei de topire4.

Interpretarea rezultatelor

Pentru un pacient, se raportează unul din cele 3 rezultate posibile:

– genotip sălbatic homozigot (negativ pentru mutaţia factorului V Leiden);

– genotip heterozigot (conţine o alelă sălbatică şi una mutantă pentru factorul V);

– genotip mutant homozigot (conţine ambele alele mutante)4.

Limite şi interferenţe

La nivelul genei factorului V, pe lângă mutaţia factorului V Leiden în poziţia 1691, mai sunt posibile alte 3 mutaţii: 1692, 1689 şi 1696. La genotipare, aceste mutaţii rare vor conduce la un rezultat fals-pozitiv (genotip heterozigot sau mutant homozigot). Deoarece numai mutaţia factorului V Leiden se asociază cu o rezistenţă crescută la proteina C activată, toţi pacienţii care prezintă un rezultat pozitiv la testul PCR vor trebui să efectueze un test funcţional (de coagulare) pentru a evalua rezistenţa la proteina C activată, în cazul în care acest screening nu s-a efectuat anterior4.