Triplu test (screening prenatal trim.II)

Informatii generale

Screening-ul markerilor serici materni a devenit un instrument important in randul obstetricienilor, in scopul identificarii sarcinilor cu risc crescut pentru anumite anomalii fetale. Desi datele actuale considera ca primul trimestru de sarcina reprezinta o optiune de screening mai eficienta decat screening-ul prenatal in trimestrul II, acesta din urma este necesar pentru:
• evaluarea riscului de defect de tub neural;
• femeile gravide care se adreseaza mai tarziu medicului obstetrician;
• pentru efectuarea testului integrat, care combina informatiile furnizate de markerii serici efectuati in primul si in al doilea trimestru de sarcina.

Screening-ul consta in determinarea serica a unor analiti produsi de fat si placenta; valorile obtinute pentru acesti markeri impreuna cu unele date clinice materne (varsta materna, varsta gestationala, greutate, rasa, status diabetic, fumat, numarul fetilor, reproducerea asistata) sunt folosite intr-un model matematic complex (realizat cu ajutorul unor programe speciale de calculator) pentru a furniza un risc calculat2. Laboratorul stabileste un cut-off (limita) pentru fiecare anomalie; obtinerea unui risc crescut indica faptul ca valoarea obtinuta depaseste cut-off-ul stabilit, dar nu are valoare diagnostica, ci mai degraba indica oportunitatea efectuarii unor investigatii suplimentare1;4;5.

Screening-ul efectuat in trimestrul II de sarcina difera in functie de numarul markerilor investigati: triplu test (AFP, estriol, HCG) sau cvadruplu test (AFP, estriol, HCG, inhibina A).

In laboratorul nostru, investigatia cunoscuta sub numele de triplu test include:
-determinarea a trei markeri serici materni: AFP, free-beta HCG si estriol neconjugat;
-calculul MoM (multiplu de mediana) pentru fiecare marker (se imparte valoarea obtinuta la mediana corespunzatoare varstei gestationale);
-corectarea MoM in functie de covariabilele materne;
-riscul de sindrom Down la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei trei markeri si a varstei materne la nastere);
-riscul de defect de tub neural la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru AFP);
-riscul de trisomie 18 la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei trei markeri si a varstei materne);
-risc pentru alte aneuploidii fetale (trisomie 13, sindrom Turner, triploidie) sau pentru sindromul Smith-Lemli-Opitz (SLOS) in cazul in care medicul trimitator/pacienta informeaza laboratorul despre existenta unei sarcini anterioare cu un anumit tip de anomalie fetala;
-calcularea MoM corectata pentru fiecare parametru seric si a riscurilor de aneuploidii fetale la nastere este efectuata de programul LifeCycle versiunea 3.03.

AFP este o proteina sintetizata in principal de ficatul fetal. Concentratia AFP in cursul sarcinii creste progresiv, de la un nivel de 0.2 ng/mL pana la aproximativ 250 ng/mL in saptamana 32 de gestatie. Nivelurile (MoM) AFP sunt mai mari in sarcinile asociate cu defecte de tub neural (anencefalie, spina bifida deschisa, encefalocel) si in medie mai scazute in prezenta sindromului Down, a trisomiei 18 si a trisomiei 13.

Estriolul neconjugat este produs de unitatea feto-placentara; nivelul sau in serul matern creste progresiv in cursul sarcinii si este tipic scazut in sarcinile asociate cu sindrom Down si trisomie 18. Estriolul este de asemenea scazut in sarcinile asociate cu sindrom Smith-Lemli-Opitz (sindrom caracterizat prin retard mintal si anomalii congenitale multiple ce are la baza un defect major in sinteza colesterolului), anencefalie fetala, sindrom Turner, hidrops fetal.

Free beta-HCG – subunitatea beta libera a HCG – este considerat a fi un marker mai relevant decat molecula de HCG intact si in trimestrul II de sarcina. In sarcinile asociate cu sindrom Down, nivelurile de free beta-HCG sunt >2 MoM. Valorile sunt de asemenea mult crescute in triploidia de origine paterna. In sindromul Turner nivelul de free beta-HCG este normal. In prezenta trisomiei 18 sau 13 precum si a triploidiei de origine materna concentratiile de free beta-HCG sunt considerabil scazute.

Pentru a obtine o standardizare atat pentru varsta gestationala cat si pentru diferentele sistematice intre populatii, laboratoare si metode de lucru, valorile obtinute la markerii serici vor fi exprimate ca MoM (multipli de mediana). MoM pentru un marker se obtine prin impartirea valorii masurate la mediana corespunzatoare varstei gestationale la care s-a efectuat determinarea, mediana ce este specifica populatiei din care face parte persoana testata si metodei de lucru utilizata in laborator4;5.

Estimarea varstei gestationale

Este efectuata de catre programul LifeCycle pe baza parametrilor ecografici (diametru biparietal BPD, lungimea femurului FL, circumferinta craniana HC, circumferinta abdominala, varsta gestationala medie stabilita ecografic)
si este exprimata in saptamani + zile; data ultimei menstruatii este introdusa de asemenea in program, insa in cazul unei discrepante intre varsta gestationala  calculata ecografic si cea determinata pe baza ultimei menstruatii (ca urmare a unui ciclu menstrual neregulat) este luata in considerare cea stabilita pe baza masuratorilor ecografice5.

Datele materne

Varsta materna

Riscul pentru trisomiile fetale (13, 18, 21) creste odata cu varsta mamei. Riscul initial („prior risk”) pentru o anomalie fetala se refera la prevalenta la nastere a defectului respectiv, specifica unei anumite varste materne; riscul este calculat pe baza unei formule ce ia in considerare prevalentele specifice varstei in diferite populatii. Pentru defectele de tub neural nu se raporteaza riscul initial, legat de varsta materna.

Sarcini anterioare afectate de aneuploidii fetale sau defecte de tub neural

Riscul pentru trisomii al unei femei care a avut in antecedente un fat sau un copil cu trisomie este mai mare decat riscul de varsta.

Daca anomalia detectata la o sarcina anterioara a aparut de novo (ca urmare a unei non-disjunctii meiotice), riscul de varsta este ajustat cu un factor aditiv configurabil. Pentru sindromul Down factorul este pre-configurat in programul LifeCycle si este derivat din meta-analiza unor date combinate provenite de la 3983 sarcini, dintre care 28 au fost asociate cu sindrom Down (Cuckle, Arbuzova 2001).

Riscul este mult mai mare in cazul in care anomalia fetala a fost mostenita; deoarece riscul este strans corelat cu modul de transmitere, programul LifeCycle nu poate furniza o estimare a riscului in acest caz4;5.

La persoanele ce au prezentat in antecedente o sarcina afectata de defecte de tub neural se inregistreaza o recurenta de 2-3%.

Aceasta informatie este luata in considerare in calculul riscului de defecte de tub neural.

Covariabile materne

Fiecare MoM va fi corectat pentru fiecare din covariabilele prezentate mai jos, atunci cand sunt furnizate informatii despre acestea. Valoarea MoM va fi impartita la un factor egal cu mediana MoM pentru sarcinile neafectate asociata cu covariabila respectiva. Aceste ajustari presupun ca efectul covariabilei asupra nivelului marker-ului nu este diferit in sarcinile afectate comparativ cu cele neafectate.

Greutatea materna

Concentratia markerilor serici este influentata de greutatea materna. Femeile cu greutate mai mare au un volum sanguin crescut, care dilueaza concentratia analitilor. Greutatea materna este folosita pentru a ajusta matematic concentratia markerilor la diferentele in volumul sanguin.

Presupunerea ca variatia MoM cu greutatea este proportional similara atat in sarcinile afectate cat si in cele neafectate este sustinuta de un studiu efectuat de Wald si Cuckle (1987) care a inclus 51 sarcini cu sindrom Down si 3000 sarcini normale.

Valoarea MoM pentru o greutate data deriva printr-o analiza de regresie a femeilor care se prezinta pentru invetigatii de rutina.

Factorul de corectie este specific unei anumite populatii deoarece depinde de distributia greutatii intr-o populatie.

Greutatea materna este utilizata si pentru a ajusta AFP MoM in screening-ul pentru defectele de tub neural.

Diabetul zaharat insulino-dependent

In medie, concentratiile celor 3 markeri serici sunt mai mici la femeile diabetice. Prezenta diabetului zaharat insulino-dependent se asociaza cu un risc de de 10 ori mai mare de defecte de tub neural. Datorita acestei combinatii de risc crescut de defecte de tub neural si un nivel mai scazut de AFP seric, pentru a se asigura aceeasi rata de detectie, programul ajusteaza MoM in functie de statusul diabetic.

Fumatul

Fumatul influenteaza concentratia markerilor serici si poate afecta performanta screening-ului. Astfel la femeile fumatoare concentratiile AFP sunt mai mari cu 5%, nivelurile de estriol sunt mai mici cu 4%, iar concentratiile de HCG sunt mai scazute cu 20%. Din acest motiv, programul ajusteaza MoM in functie de statusul fumatoare/nefumatoare1;2.

Originea etnica (rasa)

Exista variatii ale medianelor pentru  unul sau mai multi markeri serici in functie de grupul etnic la care apartine mama, de aceea programul va tine cont de aceasta informatie.

Reproducerea asistata

Studiile au aratat ca nivelul markerilor serici este modificat in sarcinile obtinute prin reproducere asistata. Din acest motiv este necesar ca medicul trimitator sa furnizeze date cu privire la procedura aplicata: fertilizare in vitro (IVF), transferul intrafalopian al zigotului (ZIFT), transferul intrafalopian al gametului (GIFT), injectarea intracitoplasmatica a spermatozoizilor (ICSI) etc. De asemenea va fi precizata data extractiei si data transferului ovulului5. In mod tipic sarcinile obtinute prin fertilizare in vitro se caracterizeaza prin niveluri HCG mai mari si concentratii de estriol mai mici.

Riscul final („posterior risk”) este estimat de catre programul LifeCycle din riscul initial si valorile markerilor serici pe baza unui model gaussian standard sau a unui model log gaussian. Astfel, pentru fiecare marker (exprimat ca MoM) se va stabili daca distributia in sarcinile afectate si cele neafectate este de tip gaussian sau log-gaussian. Pentru un singur marker, metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul de probabilitate pentru acel marker (calculat prin impartirea procentului de feti cu anomalii cromozomiale la procentul de feti normali, avand acea valoare a markerului: „likelihood ratio”). Pentru mai mult de un marker distributiile sunt multidimensionale si includ corelatii intre fiecare pereche de markeri. Metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul global de probabilitate derivat din distributiile multidimensionale4;5.

Sarcina multipla

Poate rezulta prin doua mecanisme:
-fertilizarea a mai mult de un ovocit: sarcini polizigote, cu feti diferiti din punct de vedere genetic;
-divizarea unei singure mase embrionice cu formarea de doi sau mai multi fetusi identici din punct de vedere genetic: sarcini monozigote.

In toate sarcinile polizigote fiecare embrion isi dezvolta propriul amnios, corion si placenta; in sarcinile monozigote splitarea embrionului in primele 3 zile de la fertilizare da nastere la o sarcina diamniotica dicorionica, in zilele 3-9 rezulta o sarcina diamniotica monocorionica, in zilele 9-12 se va forma o sarcina monoamniotica monocorionica, iar dupa 12 zile divizarea embrionului va genera siamezi.

Screening-ul aneuploidiilor fetale in sarcinile multiple continua sa reprezinte o provocare datorita datelor limitate si utilizarii in principal a modelelor matematice. Screening-ul bazat pe parametri serici poate fi dificil de interpretat in sarcinile gemelare deoarece nivelul biomarkerilor la un fat normal poate masca rezultatele anormale la un fat afectat; din acest motiv screening-ul nu poate fi aplicat la sarcini cu mai mult de doi feti.

In sarcinile dizigote riscul initial al mamei (legat de varsta) de anomalii fetale pentru fiecare geaman este acelasi ca pentru sarcina unica; din acest motiv riscul ca cel putin unul din feti sa prezinte o aneuploidie este dublu comparativ cu sarcina monofetala. Avand in vedere ca rata de dizigoti creste odata cu varsta materna, proportia de sarcini gemelare cu anomalii fetale este mai mare decat in sarcinile unice.

In sarcinile monozigote riscul de anomalii cromozomiale este acelasi ca in sarcinile monofetale; in marea majoritate a cazurilor ambii feti sunt afectati.

Deoarece proportia relativa de gemeni dizigoti comparativ cu cei monozigoti in populatia caucaziana este de aproximativ 2:1, prevalenta anomaliilor cromozomiale ce afecteaza cel putin un fat este de 1.6 ori mai mare decat cea corespunzatoare sarcinilor unice.

In cazul sarcinilor duble este important sa se faca distinctia ecografica intre sarcinile monocorionice (monoamniotice sau diamniotice) si dicorionice. Pe baza corionicitatii se pot face estimari mai precise in legatura cu posibila afectare a unuia sau ambilor feti. Astfel, in cazul sarcinilor monocorionice ambii feti vor fi afectati, iar riscul este similar celui din sarcinile unice. Daca sarcina este dicorionica, riscul discordantei pentru o anomalie cromozomiala este aproape dublu comparativ cu sarcina unica, in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati poate fi derivat din ridicarea la patrat a riscului pentru sarcina unica. De exemplu, o femeie de 40 ani are un risc initial de 1:100 de a prezenta o sarcina cu sindrom Down; in cazul unei sarcini gemelare dizigote riscul ca unul din feti sa fie afectat este de 1:50 (1:100 + 1:100), in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati este de 1:10000 (1:100 x 1:100). In realitate, aceasta este o simplificare, deoarece, spre deosebire de sarcinile monocorionice care sunt intotdeauna monozigote, sarcinile dicorionice sunt dizigote in numai 90% din cazuri.

In sarcinile cu doi gemeni, valorile mediane pentru markerii serici materni sunt aproape duble comparativ cu sarcinile monofetale.

Atunci cand aceasta constatare este luata in considerare in modelul matematic de calculare a riscurilor, se estimeaza ca screening-ul in trimestrul II al sarcinilor gemelare poate detecta 45% dintre fetii afectati, la o rata de rezultate fals-pozitive de 5%1;2.

Programul LifeCycle nu considera sarcina dubla ca pe o covariabila pentru care este necesar sa se faca o corectie a MoMs.

Deoarece toate studiile publicate indica faptul ca deviatiile standard si coeficientii de corelare in sarcinile duble, asociate sau nu cu anomalii fetale, sunt aceleasi ca pentru sarcinile monofetale, programul utilizeaza acesti parametri pentru sarcinile unice in calculul de risc pentru sarcinile gemelare3.

In sarcina dubla valoarea cut-off pentru screening-ul defectelor de tub neural este de 4.5-5 MoM4.

Momentul testarii

Triplul test poate fi efectuat intre saptamanile 14 si 21 de sarcina, totusi trebuie tinut cont de faptul ca in saptamana 14 nu este furnizat riscul pentru defectele de tub neural; perioada optima este intervalul 16-18 saptamani3;5.

Recoltarea

Pregatire pacienta – à jeun (pe nemancate) sau postprandial; pacientele/medicii trimitatori vor completa obligatoriu fisa de calcul de risc prenatal (care include datele clinice materne, masuratorile ecografice si varsta gestationala medie determinata ecografic).

Inaintea efectuarii testului pacientele trebuie sa fie obligatoriu informate asupra investigatiei triplu test, precum si asupra riscului de rezultate fals-pozitive si fals-negative3.

Specimen recoltat – sange venos3.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator3.

Volum proba – minim 2 mL ser3.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat3.

Stabilitate proba – serul separat este stabil:
– pentru AFP: 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C sau la -70°C;
– pentru estriol neconjugat: 5 zile la 2-8°C; 6 luni la -20°C;
– pentru free beta-HCG: 6 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; nu decongelati/recongelati3.

Metoda si interpretarea rezultatelor

• pentru markerii serici: metoda imunofluorimetrica (time-resolved fluoroimmunoassay); pentru marcare este utilizat europiu cu proprietati unice de fluorescenta;

• pentru calcul de risc: programul Wallac LifeCycle^TM (Perkin Elmer) in asociere cu Elipse Screening Engine³.

Valori de referinta

Sunt utilizate urmatoarele  cut-off-uri pentru definirea unui screening normal:

Pentru celelalte anomalii fetale este utilizat un cut-off de 1/100³. 

Interpretarea rezultatelor

Sindromul Down si trisomia 18

Risc scazut: valoarea riscului calculat este sub cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc scazut nu ofera garantia absentei sindromului Down sau a trisomiei 18. Rata de detectie a sindromului Down este de 63% pentru cazurile in care varsta gestationala s-a calculat pe baza datei ultimei menstruatii si de 70% pentru situatiile in care s-au luat in calcul datele ecografice. Pentru trisomia 18 se raporteaza o rata de detectie de 60-80%^4;5.

Risc crescut: valoarea riscului calculat depaseste cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc crescut nu stabileste diagnosticul de trisomie 21 sau 18, ci impune necesitatea efectuarii unor investigatii suplimentare (amniocenteza si analiza cromozomiala). Se raporteaza o incidenta de 5% rezultate fals pozitive pentru sindromul Down si de 0.2% pentru trisomia 18. Alte explicatii pentru un risc crescut: calcularea eronata a varstei gestationale, variatii normale sau prezenta altor anomalii cromozomiale^3;5.

Defectele de tub neural

Risc scazut: valoarea MoM calculata pentru AFP este sub cut-off-ul de 2.5 MoM AFP. Obtinerea unui risc scazut nu ofera garantia absentei defectelor de tub neural. La cut-off-ul de 2.5 MoM AFP, rata de detectie a defectelor deschise de tub neural este de aproximativ 75-80%^4;5.

Risc crescut: valoarea MoM calculata pentru AFP depaseste cut-off-ul de 2.5 MoM AFP.

Obtinerea unui risc crescut nu stabileste diagnosticul de defect deschis de tub neural ci impune necesitatea efectuarii unor investigatii suplimentare. Se raporteaza o incidenta de 3% rezultate fals pozitive. Alte explicatii pentru un risc crescut: calcularea eronata a varstei gestationale, variatii normale, sarcina multipla, anomalii cromozomiale, anomalii structurale ale placentei, defecte de perete abdominal, sangerare recenta materno-placentara. Se recomanda repetarea AFP in situatiile in care varsta gestationala este <19 saptamani, iar MoM AFP este >2.5 dar <3.5, in absenta altor cauze. Investigatiile suplimentare includ: sfat genetic, ecografie si amniocenteza pentru analiza cromozomiala si determinarea AFP in lichidul amniotic. Daca dupa efectuarea acestor proceduri, nu se gaseste o explicatie pentru valorile AFP crescute, acestea indica un risc crescut de complicatii obstetricale: ruptura de membrane si nastere prematura, preeclampsie, intarzierea cresterii intrauterine si nastere de fat mort⁵.

Limite si interferente

Triplul test nu reprezinta o metoda de diagnostic. In cazul obtinerii unui risc crescut de anomalie fetala la nastere, medicul obstetrician va hotari oportunitatea efectuarii de investigatii suplimentare. inclusiv teste diagnostice  cum ar fi amniocenteza si analiza citogenetica din lichidul amniotic.

Riscurile calculate depind de acuratetea informatiilor furnizate de pacienta/medic trimitator1;3.